【产品规格】：2×200ml/Kit

【产品组成】为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【实验前准备】

1.   适用仪器

最大离心力可达1200g的水平转子离心机。

（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在3分钟左右。）

2.  抗凝剂的选择在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验（或必须使用枸橼酸钠的医用真空抗凝采血管）。为此，天津灏洋特别开发出专利抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普通采血管获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。

3.  无菌硅化离心管

血液离体后2小时内。如达不到2小时内分血条件，请务必于4小时内进行分血步骤，超过4小时很难顺利进行分离。

5. 分离液的使用环境

a.分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b.使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在18℃-22℃环境温度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生改变，造成分离效果不佳。

6.参考值（目的细胞参考范围）

本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于    80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞，请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃（试剂需要复温。夏季20℃， 冬季23℃。）的条件下进行。

血液稀释方法：1份的PBS或样本稀释液(产品编号：2010C1119需另购)加2份的血液进行稀释（PBS:抗凝血＝1:2）；

注：稀释液要求：用不含钙镁离子的缓冲液或培养基进行血液稀释。

实验方法：方法一如下（不需血浆留存备用）：

1.取一支15ml无菌离心管，先加入5ml分离液1，后缓慢加入2ml分离液2，形成梯度界面，再缓慢吸取2-3ml新鲜抗凝血加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。或取一支50ml无菌离心管，先加入15ml分离液1，后缓慢加入5ml分离液2，再缓慢吸取5-15ml新鲜抗凝血加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。（分离液试剂总量不得少于4ml，新鲜抗凝血不得少于2ml。总液体量不得超过2/3）。

2.以500g或600g，离心30min（注：如改变血液样本及分离液用量，需相应调整离心力及离心时间。）

3.离心后，离心管中由上至下分为六层。第一层为血浆层。第二层环状乳白色为（“XX”动物）NK细胞层(第一层白环及上层50%分离液2）。第三层环状乳白色为单个核细胞层(下层50%分离液2及第二层白环)。第四层为透明分离液1液层。第五层为粒细胞层。第六层为红细胞层。

4.   ①小心吸取血浆层转移到新离心管  A    中备用（分离效果不理想，可进行后续处理方案）。

②小心吸取离心管中的（“XX”动物）NK细胞层转移到新离心管B中。

③小心吸取离心管中的单个核细胞层转移到新离心管C中。

5.   向含有（“XX”动物）NK细胞层离心管B中，加入5-10ml清洗液（产品编：2010X1118），混匀细胞。

6.   250g，离心10min。弃去上清。

7.   用吸管吸取5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8.   250g，离心10min，弃去上清。

9.   重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml    清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

实验方法：方法二如下（需留取血浆备用）：

1.首先取抗凝血，250g，离心10min，抽取血浆留存备用。补加胎牛血清(添加量与留存血浆量等同)制成细胞悬液，根据细胞悬液体积，选择适当离心管进行试验。

2.取一支15ml无菌离心管，先加入5ml分离液1，后缓慢加入2ml分离液2，形成梯度界面，再缓慢吸取2-3ml细胞悬液血加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。或取一支50ml无菌离心管，先加入15ml分离液1，后缓慢加入5ml分离液2，再缓慢吸取5-15ml细胞悬液血加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。（分离液试剂总量不得少于4ml，细胞悬液不得少于2ml。总液体量不得超过2/3）。

3.以500g或600g，离心30min。（注：如改变血液样本及分离液用量，需相应调整离心力及离心时间。）

4.离心后，离心管中由上至下分为六层。第一层为稀释液层。第二层环状乳白色为（“XX”动物）NK细胞层(第一层白环及上层50%分离液2。第三层环状乳白色为单个核细胞层(下层50%分离液2及第二层白环)。第四层为透明分离液1液层。第五层为粒细胞层。第六层为红细胞层。

5.①小心吸取稀释液层转移到新离心管A中备用（分离效果不理想，可进行后续处理方案）。

②小心吸取离心管中的（“XX”动物）NK细胞层转移到新离心管B中。

③小心吸取离心管中的单个核细胞层转移到新离心管C中。

6.向含有（“XX”动物）NK细胞层离心管B中，加入5-10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。

7.250g，离心10min。弃去上清。

8.用吸管吸取5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

9.250g，离心10min，弃去上清。

10.重复清洗两次，弃去上清，用0.5ml清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

情况一：NK     细胞层和单个核细胞层混在一起不能分开

1.   吸取全部白色环状细胞层，清洗后用备用的血浆1-2ml重悬细胞。

2.   使用分离液2重新提取NK细胞。

3.   取15ml离心管，加入4ml分离液2，将用血浆重悬的1-2ml细胞缓慢加于分离液之液面上，400g，离心20min。

4.   离心后，离心管可分为4层，第一层血浆层，第二层NK细胞层，第三层分离液层，第四层单个核细胞层。

5.   可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得NK细胞。

【注意事项】

1.本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。

2.分离液用量大于血液样本时，分离效果更佳。

3.如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持。