【包装规格】

200ml/Kit

【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【实验前准备】

1.   适用仪器

最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。

（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达 到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。）

2.   实验最佳分离时间

为获得最佳的实验结果，最好在取样  2h    内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效 果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

3.   分离液的使用环境

a. 分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 18℃-22℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。

4.   无菌硅化离心管

5. 参考值（目的细胞参考范围）

本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于   80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃， 冬季 25℃。）的条件下进行。

【卵泡单细胞悬液的制备】

1. 取卵泡液离心，弃去上清。 (注：根据样本量确定离心条件，样本量越多，离心力 越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳效果)

2. 用组织样本稀释液（产品编号：2010C1119）重悬沉淀，制成单细胞悬液，将细胞悬液 细胞浓度调整为 2×10⁸--1×10⁹/ml 。

根据卵泡单细胞悬液的量，分以下两种情况：

情况 A：样本细胞悬液量 0.5-2.0ml 时，实验方法如下：

1. 取一支 10ml 无菌硅化离心管，先加入 4ml 分离液，再缓慢吸取 0.5-2.0ml 样本细胞悬液 加于分离液液面之上。（分离液试剂不得少于 3ml，样本细胞悬液不得多于 3ml。总液 体量不得超过 2/3）。

2. 以 450g ，离心 30min。

3. 离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为组织稀释液层。第二层为颗粒细胞 层 。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞和组织细胞碎片层。

4. ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。

②小心吸取离心管中的颗粒细胞层转移到新离心管 B 中。

5. 向含有颗粒细胞的离心管 B 中，加入 5-10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。

6. 250g，离心 10min。弃去上清。

7. 用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8. 250g，离心 10min，弃去上清。

9. 重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml    清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

情况 B：样本细胞悬液量 2.0-4.0ml 时，实验方法如下：

1.  取一支 15ml 无菌离心管，先加入 6ml 分离液，再缓慢吸取 2-4ml 样本细胞悬液加于分 离液液面之上。（总液体量不得超过  2/3）。

2.  以 500g ，离心 30min。

3.  离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为组织稀释液层。第二层为颗粒细胞 层 。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞和组织细胞碎片层。

4.  ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。

②小心吸取离心管中的颗粒细胞层转移到新离心管 B 中。

5.  向含有颗粒细胞的离心管 B 中，加入 5-10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混匀 细胞。

6.  250g，离心 10min。弃去上清。

7.  用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8.  250g，离心 10min，弃去上清。

9.  重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml    清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

【注意事项】

1. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。

2. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持以寻求帮助。

【储存条件及有效期】

常温保存，有效期  2    年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如   4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

【可能存在的问题及解决方法】

1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2. 离心力公式及单位换算