密度梯度分离 > 即用型分离液
货号 | 规格 | 价格 | 货期 |
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LZS11131P | 200mL/KIT | 1350 1148 | 现货 |
详细说明
【包装规格】
200ml/Kit
【产品组成】
为方便广大用户使用,试剂内容如下:
名称 | 规格 | ||
---|---|---|---|
A | 分离液 1 | 200ml | |
B | 匀浆冲洗液 (赠品) | F2013TBD | 200ml |
C | 组织样本稀释液 (赠品) | 2010C1119 | 200ml |
D | 清 洗 液 (赠 品 ) | 2010X1118 | 200ml |
E | 红细胞裂解液 (赠品) | NH4CL2009 | 100ml |
F | 说明书 | 1 份 |
【实验前准备】
1. 适用仪器
最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。
(离心机使用时调整为慢升慢降(具体参数请咨询离心机厂家)建议升速(指开始启动→达 到设定离心力)的时间、降速(指设定离心时间完成→机器完全停止)时间均控制在 3 分钟 左右。)
2. 实验最佳分离时间
为获得最佳的实验结果,最好在取样 2h 内进行实验,样品存放时间越长,细胞分离效果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
3. 分离液的使用环境
a. 分离液需常温(15℃-25℃)避光保存,严禁冷藏冷冻保存;
b. 使用时严格遵守无菌操作规范(超净工作台或生物安全柜内),并在 20℃-25℃环境温 度下进行操作,20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围,有可能使分离液密度发生 改变,造成分离效果不佳。
4. 无菌离心管
序号 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
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1 | 无菌硅化离心管/10ml(随试剂盒附赠 5 支) | TUB2015 | 100 支/包 |
2 | PBMC 高效离心管/50ml | 601001 | 20 支/盒 |
3 | PBMC 高效离心管/15ml | 601002 | 5 支/包 |
5. 参考值(目的细胞参考范围)
本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于 80%,不是纯度。如需获得高纯度目的细胞, 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量,减少成本。
【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃(试剂需要复温。夏季 20℃,冬季 25℃。)的条件下进行。
【组织样本细胞悬液的制备】
1. 取组织块称重后,用眼科剪刀无菌操作,将组织剪成小块。
2. 将组织块放在 70µm 细胞筛网(产品编号:TBDTM-SC,需要另购)上,用研磨器反复揉 搓,边揉搓边加入匀浆冲洗液 (以 0.1g 组织为例,约加 5-8ml),使细胞全部通过筛网冲 到离心管中。
注:需要让细胞形成单个的细胞悬液冲到离心管中,而不是被研磨挤压到离心管中。 目的:使组织形成单个的细胞,而不是成团或碎片组织。单个的细胞更易分离。
3. 弃去筛网,组织研磨液经 300-400g,离心 10min,弃去上清。
4. 用组织样本稀释液重悬组织细胞,将细胞悬液细胞浓度调整为 2×108--1×109/ml (以0.1g 组织为例,约使用 0.5-1ml 组织样本稀释液重悬细胞),备用。
注:A. 多个动物组织需要分离时,应逐个单独进行,不可同时混合进行研磨。
B. 若发现匀浆冲洗液冲洗的细胞粘度较大,可进行以下处理:
①配置新冲洗液:4 份的匀浆冲洗液加 1 份的胰蛋白酶/EDTA 消化液(产品编号:TE2004Y 需另购)进行稀释,配置为新冲洗液。
②离心管预处理:再研磨开始之前,在离心管中加入 0.5-1ml 胎牛血清,进行保护 和终止胰蛋白酶/EDTA 消化液。
③再进行 2,3,4 实验步骤即可。
各种规格离心管的使用方法(推荐最佳方法)
取一支无菌离心管,加入分离液 1,后缓慢加入(人&动物)组织单细胞悬液。细 胞悬液小心加于分离液界面之上。(分离液的量不得少于 3ml,细胞悬液在 0.2-4ml 之 间) 注:细胞悬液量较多时,需小量分离。细胞悬液量较多,会稀释分离液,影响分离效果。
1. 使用 10ml 无菌硅化离心管:
A. 10ml 无菌硅化离心管最佳比例:4ml 分离液+ 0.5-2.0ml 细胞悬液;
B. 最佳离心条件:20℃环境下,400g 离心 30min。
2. 使用 15ml 离心管(或 15ml 高效离心管):
A. 15ml 普通离心管最佳比例:5ml 分离液+ 5ml 细胞悬液;
B. 15ml 高效离心管最佳比例:4ml 分离液+ 5ml 细胞悬液;
C. 最佳离心条件:20℃环境下,500g 离心 25min。
实验后续方案
1.离心后,离心管中由上至下分为五层。第一层为组织稀释液层。第二层为环状乳白色单 个核细胞层。第三层为环状乳白色(人&动物)中性粒细胞层。第四层为透明分离液层。 第五层为红细胞层和组织细胞碎片层。
2. ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。
②小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到离心管 B 中
③小心吸取离心管中的环状乳白色(人&动物)中性粒细胞层转移到离心管 C 中。
3. 向含有(人&动物)中性粒细胞的离心管 C 中,加入 5-10ml 清洗液(产品编号:2010X1118),混匀细胞。
4. 250g,离心 10min。弃去上清。
5. 用吸管吸取 5ml 清洗液(产品编号:2010X1118)重悬所得细胞。
6. 250g,离心 10min,弃去上清。
重复清洗两次,弃去上清,用 0.5ml 清洗液(产品编号:2010X1118)或根据下一步实验要求加入相对应液体,重悬所得细胞。
分离图例
【分离过程中可能出现的情况及处理方案】
情况一:中性粒细胞层混杂红细胞
1. 吸取有红细胞混杂的中性粒细胞层。
2. 取 15 毫升离心管加入红细胞混杂的中性粒细胞层,根据红细胞残余数量酌情加入 5-8 倍 红细胞裂解液。
a. 如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液(产品编号:NH4CL2009)将红细胞裂解(具体方法见“红细胞裂解液使用说明”)即得目的细胞。
b. 参考红细胞裂解液说明书操作。少时多次裂解后获得中性粒细胞。
情况二:单个核细胞层和中性粒细胞层混在一起不能分开
1. 吸取全部白色环状细胞层,清洗后用组织样本稀释液 1-2ml 重悬细胞。
2. 使用单个核细胞分离液(产品编号:LDS1075 需另购)提纯。
3. 取 15ml 离心管,加入 5ml 单个核细胞分离液,将用组织样本稀释液重悬的 1-2ml 细胞 缓慢加于分离液之液面上,400g,离心 20min。
4. 离心后,离心管可分为四层,第一层组织稀释液层,第二层单个核细胞层,第三层分离 液层,第四层中性粒细胞层。
5. 可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法,获得中性粒细胞。
【注意事项】
1. 本实验最好不使用高聚合材质(如聚苯乙烯)的塑料制品,应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品,因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面,影响细胞分离效果。
2. 分离液用量大于组织单细胞悬液样本量时,分离效果更佳。
3. 如实验后细胞得率或活性过低,请联系技术支持以寻求帮助。
【储存条件及有效期】
常温保存,有效期 2 年。本品易感染细菌,需无菌条件操作。无菌条件下操作,启 封后置常温保存。如4℃保存,本分离液易出现白色结晶,影响分离效果。
【参考值(参考范围)】
本实验中性粒细胞提取率大于 80%。
【可能存在的问题及解决方法】
1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示:
出现情况 | 出现原因 | 建议解决方案 |
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离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层 | 转速过小或离心时间过短 | 适当增减转速 |
离心后目的细胞存在于分离液中 | 转速过大或离心时间过长 | |
离心后白环层弥散 | 细胞密度过大 | 调整细胞密度 |
离心后白环层太浅或看不见 | 细胞密度过小 |
2. 离心力公式及单位换算
3. 本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心,其密度与温度、大气压等密切相关。不同地 区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时,恒定离 心时间,对离心转速进行调整。
4. 本分离液依照国际标准,全部使用药用级原料,性能指标与国产同类产品略有不同,可 能出现红细胞沉降不完全的情况,可以适当加大离心转速。
注:在对离心条件进行调整时,离心转速的加减以 50-100g 为基数,直至达到最佳分离效果, 离心力最小不得小于 400g,最大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。
备注:TBD0035SOP;2022.1229-2