3.    目的细胞最佳分离时间
血液离体后 2 小时内。如达不到 2 小时内分血条件，请务必于 4 小时内进行分血步骤，超过 4 小时很难顺利进行分离。

4.    分离液的使用环境
a. 分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；
b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 18℃-22℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。
5.    无菌离心管

6.    参考值（目的细胞参考范围）
本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于    80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。
【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃， 冬季 25℃。）的条件下进行。
血液样本需要稀释时，实验方法如下：
稀释方法：1 份的 PBS 或样本稀释液(产品编号：2010C1119)加 2 份的血液进行稀释（PBS:抗凝血＝1:2）； 注：稀释液要求：用不含钙镁离子的缓冲液或培养基进行血液稀释。
各种规格离心管的使用方法（推荐最佳方法） 
取一支无菌离心管，加入分离液，后缓慢加入血液样本或新鲜抗凝血。血液样本或 新鲜抗凝血小心加于分离液液界面之上。（若采血量较少，需小量分离，分离液的量不 得少于 3ml，抗凝血量在 0.2-3ml 之间）
1.15ml 离心管（包括高效离心管）：
A. 最佳比例：5ml 分离液+ 4ml 稀释过的血液；
B. 最佳离心条件：20℃环境下，500g 离心 25min。
注：离心后，两种情况均正常，均可以接受。取出全部（一层或两层）白细胞即可。

2.50ml 离心管（包括高效离心管）：
A. 最佳比例：20ml 分离液+ 20ml 稀释过的血液； B. 最佳离心条件：20℃环境下，650g 离心 30min。
注：离心后，两种情况均正常，均可以接受。取出全部（一层或两层）白细胞即可。

未经稀释的抗凝血分离方法（细胞培养、或需保存血浆推荐用此方法）： 3.使用 15ml 离心管（或 15ml 高效离心管）
A. 15ml 普通离心管最佳比例：5ml 分离液+ 5ml 抗凝血；
B. 15ml 高效离心管最佳比例：4ml 分离液+ 5ml 抗凝血； C. 最佳离心条件：20℃环境下，500g 离心 25min。
注：离心后，两种情况均正常，均可以接受。取出全部（一层或两层）白细胞即可。

4.使用 50ml 离心管（或 50ml 高效离心管）
A. 50ml 普通离心管最佳比例：20ml 分离液+ 20ml 抗凝血； B. 50ml 高效离心管最佳比例：15ml 分离液+ 20ml 抗凝血； C. 最佳离心条件：20℃环境下，600g 离心 30min。
注：离心后，两种情况均正常，均可以接受。取出全部（一层或两层）白细胞即可。

实验后续方案
1. 离心后，离心管中由上至下分为五层。第一层为血浆层（稀释液层）。第二层为环状乳 白色白细胞层。第三层为环状乳白色白细胞层。第四层为透明分离液层。第五层为红细 胞层。
注：离心管可能分为四层，第二层和第三层可能混淆在一起，全部取出即可。
2. ①小心吸取血浆层（稀释液层）转移到新离心管 A 中。
②小心吸取离心管中的第一层环状乳白色白细胞层转移到离心管 B 中
③小心吸取离心管中的第二层环状乳白色白细胞层转移到离心管 B 中。
3. 向含有（人＆各种动物）白细胞的离心管 B 中，加入 5-10ml 清洗液（产品编号：2010X1118）， 混匀细胞。 
4. 250g，离心 10min。弃去上清。
5. 用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
6. 250g，离心 10min，弃去上清。
重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml  清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实验要 求加入相对应液体，重悬所得细胞。
分离图例

【分离过程中可能出现的情况及处理方案】
情况一：白细胞层混杂红细胞
1. 吸取有红细胞混杂的白细胞层。
2. 取 15 毫升离心管加入红细胞混杂的白细胞层，根据红细胞残余数量酌情加入 5-8 倍红 细胞裂解液。
a. 如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液（产品编号：NH4CL2009）将红细胞裂解（具 体方法见“红细胞裂解液使用说明”）即得目的细胞。
b. 参考红细胞裂解液说明书操作。少时多次裂解后获得白细胞。

【注意事项】
1. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。
2. 分离液用量大于稀释后血液样本时，分离效果更佳。
3. 不当的稀释方法会降低细胞得率及活性。稀释液要求：不含钙镁离子的缓冲液或培养基。 血液样本经过稀释则分离过程中需适当降低离心力和离心时间。
4. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持。
【储存条件及有效期】
常温保存，有效期  2    年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如   4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
【参考值（参考范围）】 本实验白细胞提取率及大于 80%。
下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。