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小鼠淋巴细胞分离液

品牌：达优

储存：常温密封避光保存，保质期2年

本品为深圳市达科为生物工程有限公司研发的新一代密度梯度分离液。主要成份为Iodixanol， 分子量为1550。它是完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白，不 会干扰任何细胞表面膜蛋白，不会抑制酶活性，不会干扰抗原抗体反应。

本产品分离的淋巴细胞纯度高、状态好、得率高；分离方法简单易学，对操作者的经验要求不高。

本公司的研究表明，小鼠脾脏淋巴细胞在该分离液中暴露1小时，离心分离后，淋巴细胞的数量和质量没有明显变化，随后的ELISPOT检测结果同对照组完全一致。

【产品信息】

【使用方法】

自备材料：35mm培养皿、10mL玻璃注射器内活塞、70μm细胞筛网或200目尼龙网——裁成90mm×90mm正方形（以上材料均为无菌要求）、离心管、移液管、加样枪、水平转子离心机等。

【实验步骤】

1.  断颈处死小鼠，浸泡于75%的乙醇中。

2.在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作。

3.  在35mm培养皿中放入4mL-5mL小鼠淋巴细胞分离液（取用前恢复至室温并摇匀）。研磨

（研磨操作请参考图二）。

4.把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL离心管中，如图一（A），覆盖500μL-1000μL的RPMI1640培养基（保持液面分界明显），如图一（B）。

5.  室温，水平转子800g离心30min。设置较慢的升降速（如果共有十档且第十档为最高档，升降速应该调整到第三档）。离心结束后细胞分层如图一（C）所示。

6.吸出淋巴细胞层，再加入10mLRPMI1640培养基，颠倒洗涤。室温，250g离心10min收集细胞。

7.倾倒上清液，用培养液重悬细胞，计数。

【注意事项】

☆ 若小鼠饲养时间较长，或者小鼠脾脏异常肿大，导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时，须将细胞悬液用小鼠分离液等体积稀释并混匀后，再进行第4步操作。

☆分离液易挥发，每个脾脏的研磨时间应控制在5min以内。

☆分离液开封后，请尽量保存在2℃-8℃环境，避免因液体挥发造成分离液密度变化，影响分离效果。

• 大鼠脾脏淋巴细胞分离操作：

因大鼠脾脏较大，只须剪取一小部分进行实验即可，研磨与分离的方法与小鼠脾脏淋巴细胞的分离操作完全相同。

• 小鼠／大鼠／兔子血液中淋巴细胞分离操作：

1.  新鲜采集的小鼠/大鼠/兔子抗凝血液0.5mL-3mL用RPMI1640或PBS稀释一倍（血液稀释后分离效果更佳，注意无菌操作）。

2.在15mL离心管中加入3mL淋巴细胞分离液。小心地将经过稀释的血液平铺在淋巴细胞分离液液面上层，避免两种液体界面混合。

3.室温，水平转子800g离心15min-20min。设置较慢的升降速（如果共有十档且第十档为最高档，升降速应该调整到第三档）。

4.后续步骤与小鼠脾脏淋巴细胞分离操作相同。特别说明——关于小鼠脾脏研磨的达科为方法：

☆推荐使用尼龙网，因为尼龙网更柔韧。

☆推荐使用注射器活塞来研磨脾脏。

☆关键所在，利用尼龙网向上的反弹力来控制研磨的力度，将细胞可能受到的机械损伤降低到最小。

注意：

1.控制研磨力度，使尼龙网保持悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡。

2.平皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹力。

3.镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑动。

【参考文献】

1. LiliLiu,etal.AmericanJournalofNephrology.2012;36(2):386-396
2. LiZhang,etal.IranianJournalofAllergy,AsthmaandImmunology.2012;11(2):133-145
3. JianHuiXiao,etal.Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine.2012;ArticleID273435,15pages

版本号：C/3