密度梯度分离 > 即用型分离液
| 货号 | 规格 | 价格 | 货期 |
|---|---|---|---|
| LZS1100 | 200mL/KIT | 1150 978 | 现货 |
详细说明
【产品规格】
200ml/Kit
【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下：
名称 | 产品编号 | 规格 | |
|---|---|---|---|
A | 分离液 1（大/小鼠外周血中性粒分离液） | 200ml | |
B | 样本稀释液 | 2010C1119 | 200ml |
C | 清 洗 液 (赠 品 ) | 2010X1118 | 200ml |
D | 红细胞裂解液 (赠品) | NH4CL2009 | 100ml |
E | 红细胞沉降液(6%羟乙基淀粉)(赠品) | HES-TBD550-80 | 80ml |
F | 细胞分离专用抗凝剂(赠品) | TBDTM-0050 | 100ml |
G | 说明书 | 1 份 |
【实验前准备】
1. 适用仪器
最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。
（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。）
2. 抗凝剂的选择
在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验。（或必须使用枸橼酸钠的医用真空抗凝采血管） 为此，天津灏洋特别开发出专用实验动物抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普通采血管获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。
序号 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
|---|---|---|---|
1 | TBDTM 细胞分离专用抗凝剂(随试剂 盒 附赠 100ml 装：1 瓶) | TBDTM-0050 | 100ml |
2 | TBDTM-0200 | 200ml | |
3 | TBDTM-0500 | 500ml | |
4 | TBDTM 实验动物一次性使用负压采 血管 | TBDTM-0001 | 5ml/支 |
3. 无菌硅化离心管
序号 | 产品名称 | 产品货号 | 规格 |
|---|---|---|---|
1 | 无菌硅化离心管/10ml(随试剂盒附赠 5 支) | TUB2015 | 100 支/包 |
4. 目的细胞最佳分离时间
血液离体后 2 小时内。如达不到 2 小时内分血条件，请务必于 4 小时内进行分血步骤，超过 4 小时很难顺利进行分离。
血液离体时间 | 分离效果 |
|---|---|
2 小时内 | 最佳 |
2-4 小时 | 可接受 |
4-6 小时 | 细胞活性下降，分离效果不佳 |
6 小时以上 | 分离效果极差，直至分离不出细胞 |
情况B：血液样本量1.0-2.0ml时，实验方法如下：
1. 取一支 15ml 无菌离心管，加入 5ml 分离液 1，后缓慢加入 2.0ml 的 80%浓度的分离液 溶液(分离液 1：样本稀释液=4：1 的混合液)，形成梯度界面。
2. 制备血液样本：抗凝血液与红细胞沉降液按 2：1 比例混匀后，小心加于分离液梯度界面 之上（分离液加入量不得少于血液样本加入量，血液样本较多时按比例增加分离液和分离 液溶液，并更换合适离心管），800g，离心 20min。
3. 离心后，离心管中的血浆层下面将出现两层环状乳白色细胞层，上层细胞为（大/小鼠） 单个核细胞层，下层细胞为（大/小鼠）中性粒细胞层。
4. ①小心吸取血浆层转移到新离心管 A 中备用（分离效果不理想，可进行后续处理方案）
②小心吸取离心管中的单个核细胞层转移到新离心管 B 中。
③小心吸取离心管中的中性粒细胞层转移到新离心管 C 中。
5. 向含有中性粒细胞离心管 C 中，加入 3-5 倍体积清洗液（产品编号：2010X1118），混匀 细胞后，250g ，离心 10min，弃去上清。
6. 用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所的细胞，250g ，离心 10min， 弃去上清。
7. 重复清洗两次，用 0.5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。
分离图例
【分离过程中可能出现的情况及处理方案】
情况一：可见单个核细胞层和中性粒细胞层两层细胞（如果中性粒细胞纯度<70%提纯方法 如此步骤）
1. 取中性粒细胞层，清洗后用备用的血浆1-2ml重悬细胞。
2. 使用分离液 1 提纯（80%浓度的分离液 1(分离液 1：样本稀释液=4：1 的混合液)）。
a. 取10ml无菌硅化离心管，加入3ml的80%分离液1，将用血浆重悬的1-2ml中性粒细胞层细胞缓慢加于分离液之液面上，400g，离心20min。
b. 离心后，离心管底部细胞即为高纯度中性粒细胞，纯度可达90%以上。
c. 可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得高纯度中性粒细胞。
情况二：单个核细胞层和中性粒细胞层混在一起不能分开
1. 吸取全部白色环状细胞层，清洗后用备用的血浆1-2ml重悬细胞。
2. 使用分离液 1 提纯（80%浓度的分离液 1(分离液 1：样本稀释液=4：1 的混合液)）。
a. 取10ml无菌硅化离心管，加入3ml的80%分离液1，将用血浆重悬的1-2ml细胞缓慢加于分离液之液面上，400g，离心20min。
b. 离心后，离心管底部细胞即为中性粒细胞。
c. 可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得中性粒细胞。
情况三(1)：中性粒细胞层混杂红细胞
1. 吸取有红细胞混杂的中性粒细胞层。
2. 取10ml无菌硅化离心管加入红细胞混杂的中性粒细胞层，根据红细胞残余数量酌情加入5-8倍红细胞裂解液。
a. 如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液（产品编号：NH4CL2009）将红细胞裂解（具体方法见“红细胞裂解液使用说明”）即得目的细胞。
参考红细胞裂解液说明书（附后）操作。少时多次裂解后获得中性粒细胞。
情况三(2)单个核细胞、中性粒细胞、红细胞，三种细胞完全混杂
1. 吸取混杂层，清洗后用备用的血浆1-2ml重悬细胞。
2. 使用使用分离液 1（80%浓度的分离液溶液(分离液 1：样本稀释液=4：1 的混合液)）， 重新提取红细胞与中性粒细胞混杂层。
a. 取 10ml 离心管，加入 3ml 的 80%分离液 1，将用血浆重悬的 1-2ml 中性粒细胞与 红细胞混杂层缓慢加于分离液之液面上，400g，离心 20min。
b. 离心后，离心管底部细胞即为中性粒细胞与红细胞混杂层。
3. 取10ml无菌硅化离心管加入红细胞混杂的中性粒细胞层，根据红细胞残余数量酌情加入5-8倍红细胞裂解液。 参考红细胞裂解液说明书（附后）操作，少时多次裂解后获得中性粒细胞。
【注意事项】
1. 全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（夏季 20℃，冬季 22-25℃）的条件下进 行。为获得最佳的实验结果，最好在取血 2h 内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离 效果越差。血液放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2. 本实验最好不使用高聚合材质(如聚苯乙烯) 的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面， 影响细胞分离效果。
3. 分离液用量大于血液样本时，分离效果更佳。
4. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持以寻求帮助。
5. 请勿使用具有红细胞保护成分的抗凝剂，否则影响分离效果 (离心后，红细胞不能完全沉至离心管底部)。
6. 如分离的目的细胞是中性粒细胞，则抗凝血制备时，抗凝剂用量要是适量增加。
【储存条件及有效期】
常温保存，有效期 2 年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后 置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
【参考值(参考范围)】 本实验中性粒细胞提取率大于 80%。
下表为大（小）鼠外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考（参考百度文库）。
红细胞 | 白细胞 | 血小板 | |||
|---|---|---|---|---|---|
含量（个/µL） | （10.6±0.4）×103 | （2.6±0.9）×103 | （1157±123）×103 | ||
中性粒细 胞 | 淋巴细胞 | 单核细 胞 | |||
20%-30% | 50%-70% | 3%-8% | |||
出现情况 | 出现原因 | 建议解决方案 |
|---|---|---|
离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层 | 转速过小或离心时间过短 | 适当增减转速 |
离心后目的细胞存在于分离液中 | 转速过大或离心时间过长 | |
离心后白环层弥散 | 细胞密度过大 | 调整细胞密度 |
离心后白环层太浅或看不见 | 细胞密度过小 |
2. 离心力公式及单位换算
3. 本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心 时间，对离心转速进行调整。
4. 本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可 能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50- 100g 为基数，直至达到最佳分离效 果，离心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。
备注：2022.1125-4