单细胞测序技术受到越来越多关注，正是因为其与传统的转录组测序不同，单细胞测序技术能够通过对单个细胞进行分析比较，从而得到混杂样品测序所无法得到的异质性信息，发现新的细胞类型、研究生物体的细胞发育及调控机制。在单细胞（核）测序技术中，最重要的一环就是细胞（核）悬液的制备，只有制备得到纯度高、细胞（核）完整性好的悬液，才能保证后续实验的顺利进行得到有效数据以供后续生信分析。如何才能获得高质量悬液呢？相较于利用仪器设备进行分选，目前应用广泛的细胞分离纯化方法为利用密度梯度介质进行密度梯度离心。
密度梯度离心技术可根据粒子大小、形状和密度进行分离，通常通过在离心管中随密度分层，形成密度梯度。当样品在密度梯度上分层并离心时，各种粒子以不同的速率通过梯度。粒子在梯度中呈现带状；密度越大、粒子越大，迁移的越远。不同的密度梯度介质不仅可以纯化细胞（核）除去悬液中杂质，还可以同时从组分中分离所需不同细胞类型、富集外泌体、病毒等。接下来给大家详细介绍常用介质的特点以及应用范围。
蔗糖
蔗糖水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，常用于细胞器、病毒、RNA分离，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。
Ficoll 是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜，可以分离特定密度细胞的分离液，适于已知密度细胞的分离，常被用作从外周血、骨髓及脐带血中分离高活性的单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）。
Ficoll根据细胞密度的不同进行分离，单个核细胞的体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为 1.092 左右，淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075 左右。利用 Ficoll 作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集：血浆和血小板密度较低,，悬浮于分离液的上部；红细胞与粒细胞密度较大，沉于分离液的底部；PBMC 密度稍低于分离液，位于分离液界面之上。
Percoll是带有不可透析的聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 涂层的二氧化硅溶胶，可形成的梯度范围是1.0 g/mL-1.3 g/mL。Percoll分离液不穿透生物膜，对细胞无毒无害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒等。Percoll也常用于分离和纯化植物原生质体、核、叶绿体、线粒体。
Percoll是一种低粘度且密度稳定的胶体，由于颗粒大小的异质化，离心过程以不同的速率沉淀，自发产生一个匀质化且等渗的梯度，密度在1.0-1.3 g/mL之间。大部分沉淀系数＞60S的生物颗粒都可以用Percoll实现分离。（Percoll原液是低渗的，需先用10倍的高渗溶液和Percoll原液以1:9的比例配成等渗的Stock Isotonic Percoll，第二步再将SIP稀释到所需的目标密度。）
OptiPrep™主要成分是60%碘克沙醇，是一种高亲水性的非离子物质，密度为1.32 g/ml，可以用来分离多种细胞、病毒、蛋白质、核酸等不同颗粒。OptiPrep不含多糖，对细胞基本无毒，能直接进行后续实验。
OptiPrep™分离液利用缓冲液将碘克沙醇稀释到不同浓度，不同浓度溶液具有不同密度。利用不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，会在密度梯度区域上形成不同区带，从而起到纯化的目的。
不同密度梯度介质对比
种类 | 特点 |
|---|---|
蔗糖 | 价格低廉、易获得、溶液粘性大，沉降速度慢、高渗溶液，对细胞有很大的毒性 |
Ficoll | 无细胞毒性、细胞存活率高、内毒素低、适用范围相对较小 |
Percoll | 高度稳定、低渗性、无毒性、保证极高的细胞活性和完整的形态，适用范围广 |
OptiPrep™分离液 | 沉降速度快、等渗溶液，对细胞基本无毒、不影响病毒的感染效率 |
[1]Takamatsu T, Baslam M, Inomata T, Oikawa K, Itoh K, Ohnishi T, Kinoshita T and Mitsui T (2018) Optimized Method of Extracting Rice Chloroplast DNA for High-Quality Plastome Resequencing and de Novo Assembly. Front. Plant Sci. 9:266. doi: 10.3389/fpls.2018.00266.
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