重组腺病毒的制备
新冠疫情暴发以来，腺病毒载体新冠疫苗（Ad5-nCoV）就进入了紧锣密鼓的研发中。腺病毒载体新冠疫苗（Ad5-nCoV）就是把腺病毒中原有与复制相关的基因剔除，替换为新冠病毒刺突蛋白（S 蛋白）的基因。因此，腺病毒侵染宿主细胞的时候，S蛋白的基因就会释放到宿主细胞，并且引起宿主一系列的免疫反应。除了新冠疫苗，基于腺病毒载体技术平台比较有代表性的还有重组埃博拉病毒疫苗。接下来就和小达君一起了解一下腺病毒的相关知识吧。
腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜线性双链DNA病毒，直径为70～90nm，由240个六邻体和12个五邻体组成。五邻体和纤毛的头部顶球结构域可与细胞表面的受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。腺病毒载体宿主细胞范围广泛，有效感染分裂细胞和非分裂细胞，不与宿主细胞基因组整合，因而不存在插入突变风险，载体容量较大 。
腺病毒感染细胞的过程
腺病毒是通过自身的纤突（Fiber）和细胞表面的受体（如CAR）结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，从而感染细胞。
重组腺病毒的制备
腺病毒载体的分离纯化
未纯化的病毒载体中含有细胞碎片、培养基等杂质，这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主的免疫反应，所以在制备腺病毒载体时候非常关键的一步就是对其进行纯化。
分离纯化各种病毒的最常用方法密度梯度离心法，常用的介质有两种：CsCl和碘克沙醇。
CsCl是最早用于分离纯化腺病毒以及腺相关病毒（AAV）的，这种方法可获得高纯度的病毒，缺点是氯化铯对人体有毒性。
碘克沙醇密度梯度离心能保持腺病毒的高活性，并在一定程度上抑制载体颗粒物的聚集。相比于CsCl，碘克沙醇对腺病毒的总回收率较高、纯度较好，并且对人体无毒性。所以更多会选择碘克沙醇对病毒进行分离纯化。
碘克沙醇（Iodixanol）商品名Optiprep，下面就以Optiprep为例，我们一起看一下腺病毒载体以及重组腺相关病毒（rAAV）载体的纯化。
腺病毒载体的纯化
溶液准备
A. OptiPrepTM
B. 10Xpbs 包含10 mM MgCl2 和25 mM KCl (10xPBS-MK)
C. pbs包含1 mM MgCl2 和2.5 mM KCl (PBS-MK)
D. 在PBS-MK中加入2 M NaCl
E. 在PBS-MK中配置54% (w/v)碘克沙醇工作液：将9体积的OptiPrep和1体积的工作液B混合。
To prepare Solution B:
add the following to 100 ml of 10xPBS:
MgCl2.6H2O 0.20 g
KCl 0.19 g
To prepare Solution D:
Add 11.68 g NaCl to 10 ml of Solution B and make up to 100 ml.
实验操作protocol
1. 准备不同浓度的碘克沙醇溶液:
在1 M NaCl的PBS-MK 配置15% (w/v) 碘克沙醇：1.5体积的溶液E + 2.7体积的溶液D +1.2体积的溶液C
在PBS-MK溶液中配置25% (w/v) 碘克沙醇：2.5体积的溶液E + 2.9体积的溶液C
在PBS-MK 溶液中配置40% (w/v) 碘克沙醇：4.0体积的溶液E + 1.4体积的溶液C
2、通过4次冻融来破坏含有病毒的细胞:在液态氮或干冰-甲醇中速冻细胞并在室温下解冻，然后涡旋重悬两次，每次30秒，每次涡旋后在冰上停留15s。
3、2000 g离心10分钟，获得澄清的细胞裂解液。
4、分别加入不同密度的分离液从下到上依次是：1ml 54%碘克沙醇工作液，3毫升40%碘克沙醇，3毫升25%碘克沙醇，1 ml 15%碘克沙醇，最上面加入4 ml澄清的裂解液
5、在液体的最上层加入少量低密度矿物油，4℃，10万g离心 6-16小时。
6、收集腺病毒 （腺病毒带在40%碘沙醇层的顶部）。
Note:
1）病毒的纯化要使用超速离心机，建议离心管容量约14ml. 如Beckman SW41Ti或SW40Ti，SW41Ti (水平转头)最高转速41000 rpm, 最大离心力 288200g。
2)虽然水平转子可以承受更高的离心力，但是相对小的离心力有利于病毒颗粒在第一个界面处的聚集最小化，如第五步选择10万g的离心进行离心。
重组腺相关病毒（rAAV）载体纯化
腺相关病毒（AAV）是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，通常需要辅助其他病毒（如腺病毒）参与复制。腺病毒和腺相关病毒（AAV）是用于基因传递的两种不同类型的病毒载体。这两个重组病毒系统都具有感染广泛宿主的能力，两者之间的主要区别包括：包装能力、水平，基因表达的起效和持续时间以及免疫应答。同样制备重组腺相关病毒（rAAV）载体时候也会涉及到纯化，具体操作步骤如下：
溶液准备
A. OptiPrepTM
B. 10Xpbs 包含10 mM MgCl2 和25 mM KCl (10xPBS-MK)
C. pbs包含1 mM MgCl2 和2.5 mM KCl (PBS-MK)
D. 在PBS-MK中加入2 M NaCl
E. 在PBS-MK中配置54% (w/v)碘克沙醇工作液：将9体积的OptiPrep和1体积的工作液B混合。
溶液B和D的配制方法同上。
实验操作protocol
1、 准备不同浓度的碘克沙醇溶液:
在1 M NaCl的PBS-MK 配置15% (w/v) 碘克沙醇：1.5体积的溶液E + 2.7体积的溶液D +1.2体积的溶液C
在PBS-MK溶液中配置25% (w/v) 碘克沙醇：2.5体积的溶液E + 2.9体积的溶液C
在PBS-MK 溶液中配置40% (w/v) 碘克沙醇：4.0体积的溶液E + 1.4体积的溶液C
2、样本准备：4000g离心20分钟，获得澄清的细胞裂解液。
3、分别加入不同密度的分离液从下到上依次是：5ml 54%碘克沙醇工作液，5毫升40%碘克沙醇，6毫升25%碘克沙醇，9 ml 15%碘克沙醇，最上面加入10-15 ml澄清的裂解液
4、350,000 gav离心1小时 18°C。使用一个缓慢的加速和减速程序，如果条件允许，在减速期间2000rpm下关闭刹车。
5、收集重组腺相关病毒（rAAV）（rAAV带在54%和40%碘沙醇之间）。
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| 厂家 | 产品名称 |
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参考文献
1、 https://diagnostic.serumwerk.com/wp-content/uploads/2022/02/IFU-OptiPrep.pdf
2、 https://diagnostic.serumwerk.com/products/optiprep/
3、 Kol, N., Tsvitov, M., Hevroni, L., Wolf, S.G., Pang, H-B., Kay, M.S. and Rousso, I. (2010) The effect of purification method on the completeness of the immature HIV-1 Gag shell J. Virol. Methods 169, 244–247
4、 Moilanen, A-M., Rysä, J., Kaikkonen, L., Karvonen, T., Mustonen, E., Serpi, R., Szabó, Z., Tenhunen, O., Bagyura, Z., et al (2015) WDR12, a member of nucleolar PeBoW complex, is up-regulated in failing hearts and causes deterioration of cardiac function PLoS One, 10: e0124907
5、 References 1. Zolotukhin, S., Byrne, B.J., Mason, E., Zolotukhin, I., Potter, M., Chesnut, K., Summerford, C., Samulski, R.J. and Muzyczka, N. (1999) Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield Gene Ther., 6, 973-985
转自：https://mp.weixin.qq.com/s/uvwS7AkmA2KdlEUK-d1BKw